多肽合成的研究从诞生至今已经走过一百多年的光辉历程。

1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，不过进展缓慢。

1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成开始有了一定的发展。

20世纪50年代，有机化学家们在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，因此也合成了大量的生物活性多肽，包括催产素、胰岛素等，同时，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），带来了多肽有机合成上的一次革命，并因此获得1984年的诺贝尔化学奖。1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基（Fmoc）用于保护α-氨基，迅速得到广泛使用。同时，在固相合成树脂、缩合试剂以及各种氨基酸正交保护基方面，也取得了丰硕的成果。伴随着多肽合成方法的不断进步，相应的缩合剂也是不断迭代，本文就多肽缩合试剂的演化历程，展开简述。

01、基本原理

众所周知，多肽合成的基本原理，主要采用活化羧基的方法与氨基反应形成酰胺键来完成肽链的延伸。已知的成酰胺的方法主要有卤酰化、叠氮、酸酐和活化酯等。

其中卤酰化（图1-1），由于“过度激活”容易产生许多副作用，包括构型的丧失，已经较少使用。

图1-1 卤酰化机理

氨基酸酰基叠氮化物由于制备繁琐，且叠氮化合物存在一定的爆炸危险性，已经过时（图1-2），不常用，不过氨基酸酰基叠氮化合物用于片段缩合的构建被认为是一种可以抑制消旋的策略。

图1-2 叠氮化机理

酸酐，又分为对称酸酐（图1-3）和混合酸酐：对称酸酐可以用0.5eq的DIC制备，缺点很明显，就是反应性较弱，且对称酸酐不能直接在极性溶剂中制备；混合酸酐很少用在固相合成中。

图1-3 酸酐

活化酯（图1-4），常用的包括：通过DCC，DIC，EDC.HCl与HOXT制备，如下：

图1-4 常用活化酯

也可以通过酯交换制备（图1-5），例如：

图1-5 其他活化酯

经过化学家们不断地探索和研究，如今的活化酯方法已经成为多肽成酰胺的主流策略。下文将针对各种活化酯展开进一步的介绍。

02

2.1

《第一代缩合剂》

是以DCC、DIC、EDC为代表的碳二亚胺型缩合剂（图2-1），缺点：此类试剂缩合效率不高，易产生严重消旋（主要发生在路线C的过程中（图2-2）。

图2-1 DIC/DCC结构

图2-2 碳二亚胺反应机理

 2.2

《第二代缩合剂》

是基于HOBt、HOAt等添加剂的出现（图2-3）；它与碳二亚胺缩合剂、离子型缩合剂联合使用，可有效抑制消旋、提升反应速率。

图2-3 添加剂结构

其中，HOBt最常用的添加剂，性价比高；HOAT具有高活性和低消旋率的特点，可用于Aib后氨基酸的偶联；6-Cl-HOBt在反应性和价格方面，介于HOAt和HOBt之间。除此之外HOSu/NHS也可以用于生成稳定的羧基活化酯结构。

在工业应用中需要注意以下几点：

a.碳二亚胺介导的偶联反应，用DCM作溶剂较好，4~25℃；考虑到溶解性的问题，可以加入适量DMF；

b.对于可能发生链间聚集的肽链/序列，推荐使用极性更强的溶剂来抑制二级结构的形成；

c.考虑到成本因素和实际反应结果，HOXT/DIC不局限于传统的1:1当量比；

d.介于大规模投料时的放热特性，活化时有必要控制在4℃（预冷）。

2.3

第三代缩合剂

是基于HOBt和HOAt衍生的鎓盐类缩合剂，主要分为磷盐和脲盐。相较前两代，无论在反应活性，还是在产物收率、纯度方面，性能都优于其他类型缩合剂，为目前科研中使用的主流多肽缩合剂，应用相对最广泛。

磷盐中，BOP由于反应副产物的致癌性已经不常用；PyBOP/PyAOP（图2-4）是不错的替代，它可用作位阻较大的肽的消旋化抑制缩合试剂；PyClocK，由于Cl-HOBt的酸性比HOBt强，因此相应的活性酯比PyBOP或HBTU产生的活性酯活性更强。PyClocK可用于环化和片段缩合，也可提高Aib后氨基酸的缩合效率，不同于HBTU和HATU，PyClocK的过量投料不会导致缩合时氨基被胍基化封闭（胍基化副反应见下文）；缺点是价格高。

图2-4 PyBOP/PyClock结构

在各种脲盐中，最常用的是HBTU，通常加入HOBt来提高反应速度。反应机理如下（图2-5）。

图2-5 HBTU反应机理

HATU被认为是最优异的缩合剂之一，它在促进氨基酸的偶联以及抑制消旋方面均表现出优异的性能，与N -烷基胺偶联时特别有效。

HCTU（图2-6）作为 HATU 和 HBTU型脲盐缩合剂之间的一种折中方案，具有良好的偶联效率和抑制消旋性能。

图2-6 HCTU/HBTU/TBTU结构

HBTU/HATU会产生的一个典型副反应就是氨基的胍基化，它会中止肽链延伸，这种情况可能发生在片段缩合中羧基本身活性不足或溶解性差导致的预活化缓慢、不充分，或者位阻导致的反应速率较慢，此时如果存在过量的脲盐缩合剂就会与氨基发生胍基化（图2-7），此时N端被封闭，分子量多98。

图2-7 胍基化机理

针对胍基化副反应的解决方法：

a.控制HATU当量，略小于AA/片段当量；

b.溶解要彻底，充分的预活化（易消旋氨基酸如Phe，Cys，His等除外）；

c.使用 PyBOP或 PyAOP 代替作为首尾环化和肽片段的缩合剂。

2.4

第四代缩合剂

是基于Oxyma添加剂及衍生的新型缩合剂                    

Oxyma在多肽合成中表现出了优异的性能，是替代 HOBt 和其它缩合添加剂的理想选择。其优点是其衍生物原料廉价易得、合成方法简单、溶解性好、性质稳定、处理简单、副产物毒性小，有些甚至可以回收重复使用。有研究表明，在一系列实验中，Oxyma/DIC组合均表现出了不亚于甚至优于HOAt/DIC组合的能力。

由Oxyma衍生而来的COMU（图2-8），堪称偶联试剂家族中最强大的代表。

它被认为是比HATU还要优异的强力缩合剂，溶解度比HATU和HBTU高，不易爆炸，低过敏原性。COMU的副产物（如相应的尿素）具有很强的水溶性，COMU在DMF中可以制备比HBTU和HATU浓约4倍的溶液，直接影响偶联效率，甚至不需使用多余的碱，不需要酸预活化，而苯并三唑类似物需要一定的预活化时间。当然它的缺点也很明显：DMF溶液中，稳定性远不如其他试剂TOTU、HBTU和HATU等，可用于微波自动合成，但不适用于一般的自动合成，不适合缓慢偶联；环化/片段缩合时，会导致N端胍基化，另外成本也较高。

类似的缩合剂PyOxim（图2-9），其偶联反应效率优于HATU和PyBOP，与COMU相当。它在DMF中有很好的溶解性，在溶液中也相对稳定，它不会引起链终止的副反应，具有低爆性、低致敏性。

2.5

其他缩合剂

如DEPBT、DMTMM、MSNT（图2-10）等，也可应用于多肽合成，且在某些方面具有优越的性能，不过价格也相对高一些。

图2-10 DEPBT/DMTMM/MSNT结构

03

由于酰卤化和叠氮化的极端反应活性或危险性，通常在肽合成中很少使用。预成型酯被考虑用于特殊应用，其价格较高。到目前为止，在肽键形成中，原位活化酯策略(通过使用碳二亚胺或单独的偶联试剂)仍占主导地位。新型添加剂Oxyma及其衍生缩合剂在肽合成中表现优异，在工业生产中应用的越来越普遍。

然而针对不同的序列，或者同一序列的不同合成方式，缩合剂的使用也是根据具体情况而定的。例如针对Lily新上市的双靶多肽Tirzepatide，报道的一种公斤级的生产方式（图3-1），是采用了固液结合的方式进行，其中片段间缩合时，为了提高反应效率就使用了活性较高的PyOxim和HATU。

图3-1 Tirzepatide生产工艺路线

多肽合成的偶联策略并无定式，是需要针对相应序列多次工艺路线的摸索或优化后逐步形成的，这中间涉及成本、合成方式（LPPS或SPPS或LPPS+SPPS）、缩合剂（用法、用量）、氨基酸的侧链基团、温度的控制（脱保护，活化等）、洗涤/纯化方式等因素。

综上所述，随着缩合试剂和实验条件的不断改进，化学家们和多肽药物研究者们可以更方便地制备几乎任何所需的肽。这也必将极大地促进多肽和拟肽物作为治疗相关疾病的药物的发展。

参考文献：

1.Ramon Subirós-Funosas,Lidia Nieto-Rodriguez,Knud J. Jensenc,Fernando Albericioa. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J. Pept. Sci. 2013; 19: 408–414

2.Novabiochem Peptide synthesis.Anniversary Edition 2014/2015.

3.Ayman El-Faham,Fernando Albericio.Peptide Coupling Reagents,More than a Letter Soup.Chem. Rev. 2011,111,6557–6602

4.Subiros-Funosas,R.; Prohens,R.; Barbas,R.; El-Faham,A.; Albericio,F. Chem. Eur. J. 2009,15,9394. DOI: 10.1002/chem.200900614

4.Thermal Stability Assessment of Peptide Coupling Reagents

Commonly Used in Pharmaceutical Manufacturing.Org. Process Res. Dev. 2018,22, 1262−1275

5.杨翼.多肽合成副反应

6.Kilogram-Scale GMP Manufacture of Tirzepatide Using a Hybrid

SPPS/LPPS Approach with Continuous Manufacturing.Org. Process Res. Dev.

注：本文封面图片来源于网络