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企业OA中华仓鼠卵巢细胞（CHO）做为生物药物生产的重要工具，尽管目前表达量以达到g/L级别，但是高额的生产成本依然是生物药品价格居高不下的重要原因之一。随着生物制药以及CHO细胞的应用在医药行业所占比重日益增加，CHO细胞已成为各公司生产单克隆抗体及融合蛋白药物的首选，因此细胞工程对CHO细胞的改造与优化也变得极具意义。基因编辑技术的迅速发展，为CHO细胞的改造与优化也提供了良好的技术支持。
利用基因编辑技术，对CHO细胞基因组进行编辑，进行过表达，敲低或者敲除某个基因，影响CHO细胞的代谢，凋亡，转录等相关途径，从而得到高产量的重组细胞株。进行基因编辑行业内主要利用锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）4种基因组编辑技术来进行CHO 细胞系的基因改造工作。
Sigma Aldrich 公司利用ZFNs分别将CHO细胞中的谷氨酰胺合成酶（GS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）基因敲除，筛选出稳定的单克隆细胞系，用此改良后的细胞系生产生物药品，增加了系统稳定性并提高了表达量，目前已作为市场上常被生物公司选择的商业化销售细胞株[1]。CHO细胞培养中病毒的污染对生物药制品的安全性及市场化应用带来严重的损害，小鼠细小病毒（MMV)侵染CHO细胞主要依赖于其病毒衣壳与CHO细胞表面的特定多糖相结合，而CHO细胞中的SLC35A1基因在这一过程中具有重要意义，SLC35A1负责将唾液酸运输到高尔基体中。敲除该基因在细胞中的功能会产生唾液酰化的聚糖结构，从而消除了MVM与细胞结合并进入细胞的能力。MilliporeSigma 在 CHOZN® GS-/- 细胞系基础上进行了敲除SLC35A1，得到了可以抵御MMV病毒的细胞株，并且细胞株的生长以及产量并未得到影响[2][3]。TALENs技术作为ZFNs后的第二代基因编辑技术，目前应用在CHO细胞株改造案列并不多,Sakuma通过该技术将一段单链Fv-Fc基因成功靶向插入到了CHO细胞基因组内[4]。
目前表达抗体及蛋白主要使用悬浮细胞，但从ATCC得到的原始细胞株为贴壁细胞，因此需经过多次驯化，才能得到无血清培养的悬浮细胞株，满足工程细胞株高密度表达的目的。Namil Lee[5]通过链特异性RNA-seq策略获得CHO细胞悬浮驯化过程中的转录组图谱，发现在此过程中Igfbp4 和AqpI 基因下调，于是利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除CHO-K1细胞的这两个基因，大大缩短了该细胞株的贴壁到悬浮的驯化时间，降低了药物研发成本。Duncan McVey [6]等使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除TSC2基因，TSC2作为mTORC1的活性抑制剂，阻止mTORC1活性的降低有助于提高细胞的表达。敲除TSC2的细胞株，mTORC1活力上升，表型上细胞直径变大，单细胞表达量提升2倍以上，并且TSC2的敲除并未影响到蛋白及抗体质量。Salina Louie[7]通过该技术定向敲除CHO细胞中的FUT8基因（编码一种α1，6岩藻糖基转移酶），成功获得了表达无岩藻糖基化单克隆抗体的工程细胞株。随着基因组学发展，对CHO细胞的基因组更加的了解，基因编辑定向改造CHO细胞也越来越方便。Grav利用多突变 CRISPR-Cas9技术在CHO-S细胞中敲除与细胞凋亡相关的FUT8、BAK和BAX基因，与野生型CHO-S 细胞相比，敲除型细胞系显示出更好的抗凋亡能力，在Rituximab药物生产中，抑制细胞凋亡，增加了培养时间，使目的蛋白提高了187倍[8]。Wilkens在CHO细胞中敲除LDHA，在细胞发酵时防止乳酸积累，从而抑制细胞凋亡，也在Fc融合蛋白中得到应用，使蛋白产量增高2.8倍[9]。Ley 在CHO-S细胞中敲除代谢相关基因HPD, GAD2，也达到了防止乳酸积累，抑制细胞凋亡的作用[10]。Xiong在CHO-S利用CRISPR干扰技术敲除BAK, BAX, 和CASP3基因，也可抑制细胞凋亡[11]。Miao 在CHO-K1细胞中敲除BAK1基因抑制细胞凋亡[12]，在CHO-K1中敲除TSC2可增强环境适应力[13]，Jia 在CHO-K1中敲除DNMT3A可提高转基因表达的稳定性[14]。Lu 在CHO-K1中敲除CYLD基因来抑制细胞凋亡，提高细胞生长活力[15]。Wang 在CHO-K1中敲除hQSOX1和hSurvivin基因，增加代谢应激，从而诱导内质网中未折叠蛋白反应，防止UPR介导的细胞凋亡，也可提高细胞活率[16]。
CRISPR/Cas9技术作为近些年来新型基因编辑技术，深受科学家们的喜爱，利用该技术对CHO细胞工程株进行改造，是一种简单经济的方式。随着CRISPR技术的进一步扩展，对基因操作的详细控制变得更加容易，这对于生成更适合生物制药生产的细胞非常重要。另外，伴随着基因组学发展，对CHO细胞代谢网络的完善，也大大方便了CHO细胞工程的改造。
参考文献：
1. Carroll D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 2011;188:773–782
2.蔡俊立,胡泽斌,沈毅珺.基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展[J].中国医药生物技术,2017,12(02):171-173.
3.Mascarenhas JX, Korokhov N, Burger L, Kassim A, Tuter J, Miller D, Borgschulte T, George HJ, Chang A, Pintel DJ, Onions D, Kayser KJ. Genetic engineering of CHO cells for viral resistance to minute virus of mice. Biotechnol Bioeng. 2017 Mar;114(3):576-588. doi: 10.1002/bit.26186. Epub 2016 Oct 12. PMID: 27642072.
4.Sakuma T, Takenaga M, Kawabe Y, Nakamura T, Kamihira M, Yamamoto T. Homologous Recombination-Independent Large Gene Cassette Knock-in in CHO Cells Using TALEN and MMEJ-Directed Donor Plasmids. Int J Mol Sci. 2015 Oct 9;16(10):23849-66. doi: 10.3390/ijms161023849. PMID: 26473830; PMCID: PMC4632728.
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6. McVey D, Aronov M, Rizzi G, Cowan A, Scott C, Megill J, Russell R, Tirosh B. CHO cells knocked out for TSC2 display an improved productivity of antibodies under fed batch conditions. Biotechnol Bioeng. 2016 Sep;113(9):1942-52. doi: 10.1002/bit.25951. Epub 2016 Mar 6. PMID: 26888596.
7. Louie S, Haley B, Marshall B, Heidersbach A, Yim M, Brozynski M, Tang D, Lam C, Petryniak B, Shaw D, Shim J, Miller A, Lowe JB, Snedecor B, Misaghi S. FX knockout CHO hosts can express desired ratios of fucosylated or afucosylated antibodies with high titers and comparable product quality. Biotechnol Bioeng. 2017 Mar;114(3):632-644. doi: 10.1002/bit.26188. Epub 2016 Oct 4. PMID: 27666939.
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